Chef principal de l’Opéra de Lyon depuis 2017, Daniele Rustioni en devient le directeur musical en 2022. Il y dirige deux nouvelles productions chaque saison, en plus des programmes symphoniques : La Juive (Halévy), le War Requiem (Britten), Simon Boccanegra, Don Carlos, Macbeth, Falstaff et Rigoletto (Verdi), Une nuit à Venise (Johann Strauss), Mefistofele (Boito), L’Enchanteresse (Tchaïkovski), Guillaume Tell et Moïse et Pharaon (Rossini), Tosca (Puccini), Béatrice et Benedict (Berlioz), Le Coq d’or (Rimski-Korsakov) ; et en concert, Ernani, Attila et Nabucco (Verdi), Werther, Manon et Hérodiade (Massenet), ainsi que le Requiem de Verdi aux Nuits de Fourvière. Il ouvre la saison 2022-2023 avec une nouvelle production de Tannhäuser et se lance dans une exploration du répertoire allemand qui comprend La Femme sans ombre en ouverture de la saison 2023-2024. Lors de cette dernière, il dirige aussi La Fille du Far West (Puccini), La Dame de Pique (Tchaïkovski) et en version de concert Adriana Lecouvreur (Cilea), ainsi qu’un concert symphonique pour les 40 ans de l’Orchestre. Avec l’Orchestre et les Chœurs de l’Opéra, il est un invité régulier du Théâtre des Champs-Élysées à Paris ainsi que du Festival d'Aix-en-Provence.
Il devient directeur musical de l'Orchestre d'Ulster en 2022-2023 ; et en septembre 2021, il est le premier chef invité de l'Opéra de Munich. Entre 2014 et 2023, il a été directeur musical, puis directeur artistique de l'Orchestra della Toscana. Il collabore avec les grands opéras internationaux – le Staatsoper de Berlin, la Scala de Milan, l’Opéra national de Paris, le Covent Garden de Londres, ou le Teatro Real de Madrid –, fait ses débuts au Festival de Salzbourg en 2022, et est présent au Metropolitan Opera de New York en 2017, puis lors de la saison 2021-2022. En mars 2023, il y dirige les représentations de Falstaff et revient en 2023-2024 pour le gala du Nouvel An et pour Carmen (Bizet). Il est sollicité par de grands orchestres : en février 2023, il fait ses débuts au Carnegie Hall en dirigeant l'Orchestre du Metropolitan Opera de New York et fait ses débuts avec l'Orchestre symphonique de Pittsburgh. Il dirige tous les grands orchestres italiens, notamment celui de l’Académie nationale Sainte Cécile et l’Orchestre philharmonique de la Scala de Milan. Il est invité à diriger l'Orchestre philharmonique de Londres, l'Orchestre symphonique de Birmingham, l'Orchestre national du Danemark et l'Orchestre Hallé. Depuis ses débuts à la tête de Madame Butterfly à l'Opéra Nikkikai en 2014, il se produit régulièrement au Japon, avec l'Orchestre symphonique de Kyushu, l'Orchestre symphonique du HPAC, l'Orchestre symphonique de Tokyo, l'Orchestre philharmonique d'Osaka et l'Orchestre symphonique métropolitain de Tokyo.
Sa discographie comprend Adelson e Salvini de Bellini pour Opera Rara avec l'Orchestre symphonique de la BBC et le Concerto pour violon de Wolf-Ferrari sur Deutsche Grammophon avec Francesca Dego et l'Orchestre symphonique de Birmingham. Il a enregistré des œuvres de Federico Ghedini, Goffredo Petrassi et Alfredo Casella avec l'Orchestra della Toscana pour Sony Classical. En 2022, il a reçu le prix du meilleur chef d'orchestre de l'année décerné par les International Opera Awards.

Au cours de la saison 2024-2025 de l’Opéra de Lyon, il dirige Wozzeck (Berg), La Force du destin (Verdi) et, en version de concert, Andrea Chénier (Giordano) ainsi qu’un concert symphonique rassemblant Maurice Ravel et Hector Berlioz en ouverture de saison.

En juillet 2024, Daniele Rustioni est décoré de la médaille de Chevalier de l’Ordre des Arts et des Lettres.